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| Kits pour la MicroGénomique |
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Isoler des ARN même à partir
d'une cellule
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Le kit d'extraction PicoPure™ RNA a été
développé pour obtenir une haute
qualité des ARNs totaux à partir
d'un minimum de dix cellules. Le haut rendement
obtenu à partir de dix cellules en utilisant
ce kit, est aussi valable lorsque l'on travaille
à partir d'échantillons contenant
jusqu'à 100µg d'ARN. Lorsque l'ARN
est élué dans un petit volume de
10µl de tampon, il peut être utilisé
directement pour une analyse d'expression sans
aucune étape de concentration. Ce kit est
disponible en deux conditionnements pour 10 ou
pour 40 isolations.
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QRT-PCR sur ARN isolé
à partir de 1 à 1000 cellules
microdisséquées par LCM. Les
cellules de souris TM3 ATCC sont cultivées
puis centrifugées sur une lame, fixées
et deshydratées. L'ARN est purifié
à l'aide de PicoPure RNA, retranscrit
puis amplifié par QRT-PCR en essai
GAPDH en LightCycler®Roche. Un signal
quantifiable peut être identifié
à partir d'une seule cellule et le
signal de fluorescence est proportionel au
nombre de cellules. |
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| Obtenir un rendement d'ARN supérieur |
| Les petits échantillons précieux
ne peuvent pas être perdus. Faire une étude
de l'expression sur ces échantillons de valeur
demande un rendement maximum dans la récupération
des ARNs. Les études comparatives montrent
qu'à partir de petits échantillons
pauvres en ARN, le kit PicoPure™ dépasse
les performances des kits du commerce. |
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| Supprime les étapes de concentration
d'ARN |
| Le protocole simple d'extraction consiste à
extraire l'ARN des cellules, de charger ensuite
l'extrait sur une mini colonne de purification MiraCol™
qui retiendra les ARNs. Après lavage afin
d'éliminer les impuretés, l'ARN est
élué dans un volume de seulement 10µl
de tampon, et est prêt à l'utilisation,
sans étape de concentration ou peut être
transféré dans un nouveau tube. |
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| Utilise des colonnes à haut rendement
de purification |
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L'avantage unique de l'utilisation du kit
PicoPure RNA réside dans l'utilisation
d'une mini colonne : MiraCol™ à
haut rendement, développée pour
augmenter le rendement à partir d'échantillons
microscopiques. Les colonnes possèdent
un bouchon intégré afin d'assurer
le maintient de l'échantillon en conditions
" RNAse free ". Le kit est fourni
complet avec les tampons nécessaires,
un guide d'utilisation simple, des protocoles
optimisés pour la microdissection laser
à partir d'une large gamme d'échantillons |
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| Obtenir de l'ARN prêt pour
l'Amplification ou l'Analyse de Puces |
| L'ARN obtenu avec le kit PicoPure™ RNA ,obtenu
sans étape de concentration, est prêt
pour l'amplification avec le kit RiboAmp™RNA.
Ces deux kits utilisés simultanément
permettent d'obtenir des résultats reproductibles
en " Microarray ". |
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Résultats reproductibles obtenus
en microarray avec le kit PicoPure™
RNA.
Panel A : l'ARN total a été
isolé à partir de 6 échantillons
prélevés indépendemment
en LCM avec le kit PicoPure™ RNA. L'ARN
issu de chaque capture a été
amplifié deux fois à l'aide
du kit RiboAmp™ RNA. L'ARN amplifié
a été analysé par électrophorèse
en agarose à 1.25 % et coloré
avec le SYBR® Gold de Molecular Probes.
M : Marqueur.
Puits 1 : Contrôle positif amplification.
Puits 2 : Contrôle négatif.
Puits 3 : Canal rénal 1.
Puits 4 : Canal rénal 2.
Puits 5 : Glomérule de rein de
souris.
Puits 6 : rein entier.
Puits 7 : Lignée SKBR3 (250 cellules).
Puits 8 : Lignée SKBR3 (500 cellules).
Panel B-C : Coupes de rein de souris congelé
préparées avec le kit de coloration
HistoGene™. Deux captures de 1 500
cellules de canal rénal murin sont
réalisées. L'ARN de chaque
capture est isolé à l'aide
du kit PicoPure™ RNA et amplifié
deux fois par le kit RiboAmp™ RNA.
Les ARNs amplifiés sont marqués
au Cy5-dUTP et hybridés sur un microarray
de cDNA de 9 000 éléments
murins. Une région de deux arrays
est montrée pour démontrer
qu'un pattern d'expression similaire d'un
gène peut être mis en évidence.
Les deux régions montrent un haut
degré de corrélation (R2 =
0.954)
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| Retient les ARNs de faible abondance |
| Le kit d'extraction PicoPure RNA préserve
les ARNm de toutes les classes d'abondance tout
au long de la procédure d'isolation, minimisant
la perte de gènes d'intérêts
importants. Faible, moyenne et haute classes d'abondances
de gènes sont obtenues et sont utilisables
pour les analyses d'expression. |
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| RT-PCR sur des ARNs de gènes en faible,
moyenne et forte abondance isolés à
l'aide du kit PicoPure™ RNA. La RT-PCR a été
réalisée sur 500 cellules capturées
à partir de coupes de foie et de rein de
souris. Des quantités égales de cDNA
ont été analysées avec 3 sets
de primers Stratagene : facteur d'élongation1-a
(EF-1a, gène d'abondance élevée,
~3000 copies par cellule, 187 pb), Glyceraldehyde-3-phosphate
Dehydrogenase (GAPDH, gène d'abondance moyenne,
300-3000 copies/cellule, 357 pb), et Protein Phosphatase
1 (PP1, gène de faible abondance, <300
copies/cellule, 498 pb). Les échantillons
sont analysés par électrophorèse
en acrylamide à 6% et marqués par
SYBR Gold. M: Marqueur moléculaire. Puits
1 : Rein EF-1a. Puits 2 : Foie EF-1a. Puits 3 :
Rein GAPDH . Puits 4 : Foie GAPDH. Puits 5 : Rein
PP1. Puits 6 : Foie PP. Puits 7 : Foie EF-1a contrôle
sans RT. Puits 8 : Contrôle échantillon
sans RT. |
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| Maintient une haute qualité d'ARN |
| La procédure d'extraction du kit PicoPure
RNA assure une haute qualité de l'ARN. L'ARN
total obtenu à partir d'échantillons
microdisséqués reste intact après
l'extraction, ce qui augmente la confiance à
travers les Analyses Moléculaires qui en
découlent. |
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Le kit PicoPure™
RNA préserve l'intégrité de
l'ARN. Des coupes histologiques de rein de souris
sont préparées avec le kit HistoGene™.
Une quantité importante de cellules (15,000)
a été capturée par LCM alors
qu'une coupe contrôle est purifiée
pour comparaison. L'ARN total est extrait à
partir des deux prélèvements avec
le PicoPure™ RNA puis analysé par électrophorèse
à l'aide d'un Agilent Bioanalyzer 2100.
Puits 1 : ARN total à partir de cellules
non capturées par LCM. Puits 2 : ARN total
à partir de cellules capturées par
LCM. Les intensités des bandes 18S et 28S
sont comparables entre les deux prélèvements. |
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Pour usage laboratoire uniquement.
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